天津医科大学生物化学与分子生物学
1.蛋白质化学考试内容⚫氨基酸的分类，20种常见氨基酸的简写符号1.非极性氨基酸：甘氨酸(Gly) 丙氨酸(Ala) 缬氨酸(Val)亮氨酸(Leu)异亮氨酸(Ile) 苯丙氨酸(Phe)脯氨酸(Pro)色氨酸(Trp)蛋氨酸[甲硫氨酸](Met)2、不带电荷极性氨基酸：丝氨酸(Ser) 酪氨酸(Tyr) 半胱氨酸(Cys)天冬酰胺(Asn) 谷氨酰胺(Gln) 苏氨酸(Thr)3、带负电荷氨基酸(酸性氨基酸)(2):天冬氨酸(Asp) 谷氨酸(Glu)4、带正电荷氨基酸(碱性氨基酸)(3):赖氨酸(Lys) 精氨酸(Arg) 组氨酸(His) ⚫氨基酸的理化性质和化学反应1. 两性解离及等电点等电点:在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。2. 紫外吸收(1)色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280 nm 附近。(2)大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。3. 茚三酮反应氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。4.α-氨基酸都是白色晶体，每种氨基酸都有特殊的结晶形状，可以用来鉴别各种氨基酸。除胱氨酸和酪氨酸外，都能溶于水中。脯氨酸和羟脯氨酸还能溶于乙醇或乙醚中。除甘氨酸外，α-氨基酸都有旋光性，α-碳原子具有手性。 ⚫氨基酸混合物的分析分离氨基酸的分离主要利用氨基酸的物理和化学特性的差别，特别是溶解度(极性)和电离特性的差别。1、层析层析也称为色谱，是一种分离和分析方法，基本原理是基于氨基酸的溶解度性质。分配层析：混合物在层析系统中的分离决定于混合物组分在这两相中的分配情况，即决定于他们的分配系数。目前应用较广泛的分配层析形式主要有柱层析、纸层析和薄层层析等。用在氨基酸分离的主要有离子交换层析、气相层析、HPLC。离子交换层析：是一种基于氨基酸电荷行为的层析方法。经常使用的填充是离子交换树脂，常使用强酸型阳离子交换树脂（ 可以解离出H+）。将氨基酸在pH2~3上样，氨基酸主要以阳离子形式存在，与树脂上的纳离子发生交换而被挂在树脂上。结合的牢固程度取决于氨基酸与树脂之间的亲和力，主要是静电吸引。pH3左右时，氨基酸和树脂之间的静电吸引大小是碱性氨基酸＞中性氨基酸＞酸性氨基酸，所以洗脱顺序是酸性氨基酸，中性氨基酸，碱性氨基酸（ 常作为填空题考点）。为了洗脱下来可以降低它们之间的亲和力，可以采取逐步提高洗脱剂pH和盐浓度的方式。2、电泳是指带电的颗粒或生物分子在外加电场作用下，向带相反电荷的电极做定向移动的现象。在待分离样品中，各种生物分子的带电性质以及大小、形状等存在的差异使得它们的“泳动”速率不同，因而可以利用电泳技术对它们进行分离、鉴定或纯化。对二硫键的测定常常采用对角线电泳。 ⚫蛋白质的化学组成和分类蛋白质的元素组成：C、H、O、N、S，其中含N平均为16％，这一数据可用于蛋白质的含量测定。分类：简单蛋白：完全由氨基酸组成，不含非蛋白成分。结合蛋白：由蛋白质和非蛋白成分组成，后者称为辅基。按照蛋白质的生物学功能分类：催化功能、结构功能、运输功能、贮存功能、运动功能、防御功能、调节功能、感觉功能、遗传调控功能、其他功能。 ⚫肽和肽段的结构及物化性质肽键是由一个氨基酸的a-羧基与另一个氨基酸的a-氨基脱水缩合而形成的化学键。肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽，由50个以上的氨基酸组成的肽通常被称为蛋白质。肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基。多肽链是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。多肽链有两端：N 末端：多肽链中有自由氨基的一端C 末端：多肽链中有自由羧基的一端肽的理化性质与氨基酸类似，但有一些特殊的反应，如双缩脲反应。一般含有两个或两个以上肽键的化合物都能与 CuSO4 碱性溶液发生双缩脲反应而生成紫红色或蓝紫色的复合物 ⚫蛋白质分子的结构(一级、二级、高级结构的概念及形式)蛋白质的一级结构1、定义：蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的连接方式、排列顺序和二硫键的位置。2、主要的化学键：肽键，有些蛋白质还包括二硫键。3、一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础的复合物蛋白质的二级结构1、定义：蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象2、主要的化学键：氢键3、蛋白质二级结构的主要形式a-螺旋、b-折叠、b-转角、无规卷曲蛋白质的三级结构1、定义：整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。2、主要的化学键：疏水作用、离子键、氢键和Van der Waals力等蛋白质的四级结构1、蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。2、亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。 ⚫蛋白质一级结构的测定测序过程1. 纯化目标蛋白2. 拆分肽链3. 打破二硫键4. 分析各单链的氨基酸组成5. 末端氨基酸残基的鉴定6. 将肽链切成小的肽段7. 选择不同切点，重复8. 根据片段重叠法，推测肽链的全序列9. 定位二硫键测序方法1.末端分析（1）N 末端蛋白质的末端氨基与(sanger发明)2，4-二硝基氟苯(DNFB)在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基蛋白质（DNP-蛋白质），产物黄色。目前应用最广泛的是异硫氰酸苯酯(PITC)法。（2）C 末端肼解法，也可用羧肽酶法鉴定。2. 二硫键的拆开和肽链的分离胰蛋白酶：最常用，专一性强，断裂Lys或Arg残基的羧基侧肽键胰凝乳蛋白酶：断裂Phe，Trp，Tyr等疏水氨基酸残基的羧基侧肽链胃蛋白酶：断裂Phe，Trp，Tyr或Val等疏水氨基酸残基的氨基侧肽链3. 肽段氨基酸序列测定Edman化学降解法质谱法通过基因的核苷酸序列推定多肽的氨基酸序列 ⚫蛋白质的理化性质及蛋白质分离纯化蛋白质是两性电解质，分子中的可解离基团主要是侧链基团，也包括末端氨基和羧基蛋白质是大分子，在水溶液中的颗粒直径在 1－100 纳米之间，是一种分子胶体，具有胶体溶液的性质，如布朗运动、丁达尔现象、电泳、不能透过半透膜及吸附能力等。根据蛋白质的分子大小分离（1）透析：利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开（2）超滤：利用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质的目的。使蛋白质沉淀而分离（1）丙酮沉淀、乙醇沉淀（2）盐析：将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。（3）免疫沉淀：利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。根据蛋白质荷电性质电泳而分离（1）薄膜电泳：将蛋白质溶液点样在薄膜上，薄膜两端分别加正、负电极，此时带正电荷的蛋白质向负极泳动；带负电荷的向正极泳动；带电多，分子量小的蛋白质泳动速度快；带电少，分子量大的则泳动慢，于是蛋白质被分离。（2）凝胶电泳：凝胶置于玻璃板上或玻璃管中，凝胶两端分别加上正、负电极，蛋白质混合液即在凝胶中泳动。电泳结束后，用蛋白质显色剂显色，即可看到多条已被分离的蛋白质色带。（3）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：十二烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质分子间的电荷差异消失，此时蛋白质在电场中的泳动速率仅与蛋白质颗粒大小有关，常用于蛋白质分子量的测定。 （4）等电聚焦电泳（IFE）：通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。根据相分配或亲和原理分离层析：待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配、并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。（1）离子交换层析：带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，故可将蛋白质分离。（2）凝胶过滤：层析柱内填满带有小孔的颗粒，蛋白质溶液往下渗漏，小分子蛋白质进入孔内，因而在柱中滞留时间较长，大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出，因而不同大小的蛋白质得以分离。 ⚫蛋白质的含量测定和蛋白质纯度鉴定含量测定1. 双缩脲法凡是具两个以上肽键的物质均会也能起双缩脲反应，形成红紫色络合物，此反应可用于定性鉴定2. 黄色反应含有芳香族氨基酸特别是酪氨酸和色氨酸的蛋白质在溶液中遇到硝酸后，先产生白色沉淀，加热则变黄，再加碱颜色加深为橙黄色3. 米伦反应蛋白质加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后变成红色。4. 乙醛反应5. 坂口反应6. 费林反应（Folin-酚）7. Bradford法8. 胶体金纯度鉴定蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法。例如等电聚集、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)、毛细管电泳以及沉降分析 ⚫蛋白质的变性作用天然蛋白因受物理或化学因素影响，高级结构遭到破坏，致使其理化性质和生物功能发生改变，但并不导致一级结构的改变，这种现象称为变性，变性后的蛋白称为变性蛋白。二硫键的改变引起的失活可看作变性 ⚫蛋白质结构与功能的关系结构是功能的基础，决定着蛋白质的生物学功能，每一种蛋白质都具有特定的结构，也具有特定的功能。一旦结构（特别是高级结构）破坏，其功能随之丧失。蛋白质的高级结构决定蛋白质的功能。蛋白质的一级结构决定其高级结构，因此，最终决定了蛋白质的功能。一级结构相似的蛋白质具有相似的功能。功能相似的蛋白往往能显示它们在进化上的亲缘关系，这是研究分子进化的基础。许多疾病是蛋白质结构异常引起，属于构象病。 考试要求⚫了解氨基酸、肽的分类⚫理解氨基酸的通式与结构⚫理解蛋白质二级和三级结构的类型及特点，四级结构的概念及亚基⚫掌握氨基酸与蛋白质的物理性质和化学性质⚫掌握氨基酸混合物的分离方法⚫掌握蛋白质的变性作用⚫掌握目前蛋白质一级结构的测定方法⚫掌握蛋白质结构与功能的关系⚫掌握蛋白质的分离纯化的原则和方法 ......
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